GAD预防NOD鼠胰岛炎的机理研究

发布时间:2021-07-31 23:58:30


GAD预防NOD鼠胰岛炎的机理研究
2010-03-25 杨竹林 周智广 伍汉文 廖二元 杨文

  【摘要】 目的 研究本室自制猪脑GAD是否能保护NOD鼠胰岛β细胞免遭破坏及其意义。方法 在4周龄NOD鼠注射GAD,对照组注射等量牛血清白蛋白(BSA),分别于19周龄、25周龄和47周龄处死,胰腺组织常规制成石蜡切片,ABC免疫组化染胰岛β细胞并光镜下计数。结果 同周龄GAD组发生胰岛炎程度和胰岛炎评分均明显低于BSA组:同周龄GAD组胰岛β细胞计数明显高于BSA组,均有显著性差异(P<0.001);胰岛炎分值与胰岛β细胞阳性率存在密切负相关(P<0.001)。结论 本室自制猪脑GAD能减轻NOD雌鼠胰岛炎的发生和保护胰岛β细胞免遭破坏的作用。
  【关键词】 NOD鼠  β细胞  谷氨酸脱羧酶  免疫组织化学

Prevention of insulitis by glutamic acid decarboxylase in NOD mice  Yang Zhulin,Zhou Zhiguang,Wu Hanwen,et al.Institute of Metabolism and Endocrinology,Hunan Medical University,Changsha,410011
  【Abstract】 Objective To study whether porcine brain glutamic acid decarboxylase (GAD) purified in our laboratory can protect β cells. Methods GAD or BSA (control) was injected intraperitoneally into female NOD mice at age of 4 weeks and they were killed separately at 19th, 25th and 47th week. Pancreatic tissues were made into paraffin sections routinely. The islet β cells were stained by ABC immunohistochemical method and counted under microscopy. Results Both incidence and scoring of insulitis were significantly lower in GAD group than that in BSA group of the same age. The number of β cells were significantly higher in GAD group than in BSA group of the same age. A negative correlation was found between score of insulitis and number of β cells in islets (P<0.001). Conclusion The pocrine brain GAD purified in our laboratory ameliorates insulitis and mitigates the damage of β cells in islets in NOD mouse.
  【Key words】 NOD mouse  β cells  Glutamic acid decarboxylase  Immunohistochemistry

(Chin J Endocrinol Metab, 1998, 14:315-317)

  NOD小鼠(Non-obese diabetic mouse)是一种遗传性1型糖尿病的啮齿动物模型,其发病机理为T细胞介导的胰岛β细胞进行性破坏和数量减少〔1〕。国外学者*年发现1型糖尿病胰岛自身抗原——谷氨酸脱羧酶(GAD)在预防NOD鼠胰岛炎及糖尿病发生中显示良好效果〔2,3〕。本文应用自制猪脑GAD于NOD鼠,观察NOD鼠胰岛内β细胞计数及其意义。

材料和方法

  一、材料
  NOD 鼠从澳大利亚 WEHI 医学研究 中心引进,由山西医科大学张志利教授提供。本实验采用的NOD雌鼠群落在210天龄糖尿病自然发病率为70%。所有小鼠在标准饲养环境下喂养,自由饮净化水及全价营养颗粒饮食。
  二、方法
  25只4周龄NOD雌鼠分成GAD组和BSA组(对照组)。GAD组共15只,于4周龄腹腔内注射GAD 2.4mU酶活性单位(100μl),分别于19周龄(6只)、25周龄(4只)和47周龄(5只)处死。BSA组共10只,于4周龄腹腔内注射BSA 1mg(100μl),分别于19周龄(4只)和47周龄(6只)处死。处死后按常规取下胰腺后置10%中性福尔马林液固定,常规制作石蜡切片,厚4μm。
  GAD由本所按文献方法制备〔4〕,将新鲜猪脑粗提,HPLC层析分离,收集GAD酶活性峰,本所制备的GAD含两种同功酶(GAD65和GAD67),产品含蛋白质10mg/ml,含酶活性单位24mU/ml。BSA由上海第二医科大学生产。鼠抗人和动物胰岛素单克隆抗体(1/100)、生物素标记羊抗鼠lgG(1/300)和ABC试剂(1/500)均购自Sigma公司;DAB-HCl由瑞士进口分装。
  胰岛炎评分参照Guytingco和Tisch评分标准〔5,6〕,每只鼠胰在HE染色和高倍镜(HP)下随机计数10个胰岛分值,所得值0分示正常胰岛,1~2分示胰岛周围炎,3~4分示胰岛内炎。胰岛β细胞染色为ABC免疫组化法,β细胞胞浆呈淡棕黄色至深棕黄色颗粒,以0.01M PBS (PH7.4)替代一抗、二抗或ABC试剂作为每次染色阴性对照;高倍光镜下每一切片中随机计数5个胰岛内β细胞数、胰岛炎分值及胰岛内细胞总数,胰岛内β细胞阳性率=β细胞数/胰岛细胞总数。
  三、统计学方法
  应用t检验、直接概率法及直线回归与相关分析。

结  果

  一、胰岛炎发生程度
  19周龄鼠中,6只GAD组鼠均为胰岛周围炎,4只BSA组鼠1只为胰岛周围炎和3只为胰岛内炎,两者存在显著差异(P=0.0333)。25周龄鼠中,4只GAD组鼠3只为胰岛周围炎,1只为胰岛内炎,本组无BSA组鼠。47周龄鼠中,5只GAD组鼠3只为胰岛周围炎,2只为胰岛内炎,6只BSA组鼠1只为胰岛周围炎,5只为胰岛内炎,两者无显著差异

附表 GAD组胰岛炎评分和β细胞计数阳性率与BSA组比较()
Table Comparison of scores of insulitis and number of β
cells between GAD and BSA group


分组
Group 例数
n 胰岛炎评分
Scoring of insulitis
n'=n×10 β细胞计数
No. of β cells
n'=n×5
19W GAD组
19W GAD group 6 1.266±0.795 0.6790±0.1098
19W BSA组
19W BSA group 4 2.283±0.985**△△ 0.4966±0.2136**△△
25W GAD组
25W GAD group 4 1.235±0.899 0.6681±0.0919
47W GAD组
47W GAD group 5 1.175±1.022 0.6920±0.0632
47W GAD组
47W GAD group 6 2.531±1.071**△△ 0.4949±0.1347**△△

  注:与同周龄GAD组比较 Compared with GAD of same age,**P<0.001;与25W GAD组比较 Compared with 25W GAD,△△P<0.001

(P=0.197)。附表所示,GAD组鼠胰岛炎评分均数均明显低于BSA组鼠,均有高度显著差异。
  二、胰岛内β细胞计数(附表)
  GAD组胰岛内β细胞计数阳性率均明显高于同周龄BSA组,均有高度显著差异;25周龄GAD组鼠胰岛内β细胞计数阳性率也明显高于19周龄、47周龄BSA组鼠,均有高度显著差异(图1,2)。


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